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Ricerca sulle cellule staminali Astratto È stata sviluppata una tecnologia semplice, scalabile e riproducibile come il grasso ti aiuta a perdere peso consente la formazione diretta di un gran numero di corpi embrioidi EB omogenei e sincronizzati di dimensioni definite da cellule staminali pluripotenti dissociate indotte dall'uomo hiPSC.

Idrogel non adesivi per cellule sono stati usati per creare micropozzetti a fondo tondo per ospitare hiPSC dissociati. Il requisito chiave per la corretta formazione di EB in aggiunta ai pozzetti con fondo arrotondato non heb sfida di perdita di peso per cellule è la densità delle celle di input per micropozzetto.

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Troppe o troppe celle caricate nei micropozzetti comprometteranno il processo di formazione di EB. Parallelamente, abbiamo testato il nostro sistema basato su micropozzetti per la formazione omogenea di hEB da cellule staminali embrionali umane dissociate hESC.

La riuscita produzione di hEB omogenei da hESC dissociati in assenza di ROCK-i e centrifugazione è stata raggiunta in un intervallo ottimale di densità delle cellule di input per micropozzetto. Originariamente derivate da cellule adulte umane mediante trasduzione di una combinazione di quattro fattori di trascrizione, ovvero Oct4, Sox2, C-myc e Klf4 1, queste cellule pluripotenti presentano un autorinnovo illimitato a lungo termine e una capacità di differenziazione pluripotente simile all'embrione umano cellule staminali hESC evitando polemiche etiche 2, 3.

Analogamente agli hESC, gli hiPSC sono in grado di differenziarsi in cellule costituendo tutti e tre gli strati germinali somatici 4. Mentre gli hiPSC mantengono le promesse non solo come uno strumento per la modellizzazione della malattia e lo studio dello sviluppo embrionale precoce, ma anche per le terapie di sostituzione cellulare e lo screening dei farmaci, i problemi tecnici rimangono prima che la loro utilità possa essere sfruttata al massimo.

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In particolare, la differenziazione spontanea efficiente e diretta di hiPSC in lignaggi cellulari desiderabili con elevata efficienza in modo controllato e riproducibile è importante per le applicazioni terapeutiche, che richiedono grandi quantità di una o più popolazioni cellulari specifiche. Lungo le traiettorie di differenziazione hiPSC, la formazione del corpo embrionale EB è una fase induttiva di routine che determina la differenziazione a valle per ulteriori applicazioni. Gli EB sono aggregati cellulari tridimensionali che imitano una struttura dell'embrione in via di sviluppo e possono differenziarsi in cellule di tutti e tre gli strati germinali 5.

Gli EB sono beneficiari nell'avvio della differenziazione specifica del lignaggio verso molti lignaggi come cardiaci 6, 7, neurali 8, 9 e ematopoietici 10, Sebbene l'EB consenta la generazione di cellule in tutti e tre gli strati germinali primari, i risultati della differenziazione dipendono fortemente dalla qualità degli EB, che è influenzata dalle condizioni medie 12, dal numero di cellule e dalle dimensioni degli EB 6, Ad esempio, la redditività dell'EB e il rendimento nella differenziazione terminale variano in modo dipendente dalla dimensione Mentre gli EB troppo piccoli non sono sopravvissuti bene durante le procedure di differenziazione, gli EB troppo grandi sono stati sottoposti a necrosi core Inoltre, le diverse dimensioni di EB hanno alterato la resa nella loro differenziazione terminale verso lignaggi cellulari funzionali 6, Esiste una gamma di dimensioni EB ideale per la migliore redditività e differenziazione diretta.

Per garantire che tutti gli EB si formino da hiPSC della stessa composizione di input e che gli EB formati siano sincronizzati spazialmente e temporalmente, la sospensione dissociata di una singola cellula di hiPSC è un percorso ideale da prendere.

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Consente inoltre un controllo rigoroso dei numeri di cella in ciascun EB per controllo di dimensione e coerenza. Il principio coinvolto nella produzione di EB da sospensione singola cellula dissociata riguarda la prevenzione dell'attaccamento cellulare ai substrati di coltura e la promozione dell'aggregazione cellulare pur rimanendo in sospensione.

Per ottenere EB di dimensioni uniformi, gli sforzi sono stati diretti alla creazione di superfici di coltura non adesive 16 e alla somministrazione di fattori solubili nei terreni di coltura che promuovono le interazioni cellula-cellula.

Metodi come la coltura in sospensione statica non hanno il controllo sull'omogeneità dei fattori ambientali a cui sono esposte le singole cellule e non sono suscettibili di produzione di massa scalabile. La cultura di sospensione statica produce un'ampia varietà di dimensioni EB Heb sfida di perdita di peso metodo più controllabile per la produzione di EB prevede micropozzetti. I micropozzetti non adesivi sono stati usati per coltivare ESC di topo dissociati e promuovere la formazione di EB 11, 17, Definendo il numero di ESC seminate in ciascun pozzo separato e forzando l'aggregazione mediante centrifuga, questo metodo è in grado di controllare con precisione la dimensione dell'EB e produrre EB omogenei.

Tuttavia, richiede la centrifugazione e la manipolazione individuale degli EB formati manualmente e una fase di placcatura aggiuntiva per ulteriore coltura e maturazione. Recentemente, sono stati sviluppati bioreattori di vari design per indurre la formazione e la differenziazione di EB in un modo scalabile ben definito 19, I bioreattori offrono i heb sfida di perdita di peso di una facile produzione su larga scala di EB, parametri di coltura controllabili ed elaborazione efficiente del lavoro.

Il potere bruciare i grassi dipende fortemente dal design dei bioreattori L'agitazione a bassa velocità provoca un agglomerato EB esteso che ostacola il trasporto di massa, mentre l'agitazione ad alta velocità è dannosa per le cellule In alternativa, vengono utilizzati recipienti rotanti per fornire un movimento circolare costante che migliora l'efficienza della formazione di EB I sistemi che combinano diversi tipi di bioreattori 24, incapsulamento con bioreattori 25 o cultura di sospensione statica seguita da bioreattori 24 sono stati tentati di aumentare la formazione di EB e indirizzare la differenziazione in lignaggi terminali senza compromettere le proprietà delle cellule staminali di auto-rinnovamento.

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Nonostante questi sforzi, il trapianto di cellule differenziate prodotte nei bioreattori non ha indicato benefici per la riparazione dei tessuti probabilmente a causa della microeterogeneità ambientale nei bioreattori che potrebbe avere alterato la pluripotenza e la differenziazione delle cellule, dando heb sfida di perdita di peso a popolazioni di cellule altamente eterogenee e differenziazione disorganizzata È interessante notare che gli hiPSC dissociati sono più vulnerabili all'apoptosi rispetto ai cluster, con conseguente scarsa produzione di EB da hiPSC dissociati Agenti protettivi, come l'inibitore della chinasi ROCK associato a Rho, Y, hanno dimostrato di migliorare la vitalità dei singoli hiPSC dissociati senza influire sulla pluripotenza, possibilmente prevenendo gli anoiki o incoraggiando le interazioni cellula-cellula che portano all'aggregazione Poco si sa circa gli effetti di ROCK-i a livello cellulare e quale potenziale danno cellulare potrebbe infliggere.

ROCK-i ha dimostrato di influenzare il destino delle cellule verso la pluripotenza residua negli studi sulla differenziazione neurale, rendendo queste cellule inadatte alle terapie cellulari Inoltre, molti dei metodi costringono l'aggregazione cellulare mediante centrifugazione ovvero il metodo spin EB 11, 17, 18, che potrebbe potenzialmente danneggiare le cellule e sfidare i tentativi di automazione.

In una recente revisione della letteratura, ROCK-i o centrifugazione sono stati considerati necessari per stimolare iPSC dissociati per raggrupparsi e aggregarsi durante la formazione di EB Un altro svantaggio comune dei metodi esistenti per la produzione di EB è la variabilità da cultura a cultura, che compromette l'uso degli EB come sistema modello e una fonte di cellule differenziate per applicazioni sia in ambito di ricerca che clinico.

È urgente un nuovo paradigma scalabile per dirigere una formazione di EB ben definita che consenta una successiva differenziazione sincrona in una specifica linea cellulare di interesse in modo riproducibile.

A questo proposito, abbiamo studiato i parametri chiave nella formazione di hEB e sviluppato una semplice tecnica scalabile per consentire la formazione diretta di EB omogenei e sincronizzati dalla sospensione dissociata di una singola cellula di hiPSC senza la necessità di ROCK-i o centrifugazione. Le condizioni ambientali applicate in ogni fase durante il processo sono ben regolate e standardizzate per aumentare la produzione e il controllo delle proprietà delle cellule.

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L'agarosio presente in natura, un biomateriale polisaccaridico non adesivo 16, 30, è stato utilizzato per creare uno stampo master di configurazione a micropozzetti per ospitare la sospensione dissociata a cella singola di hiPSC.

La natura non adesiva del micropozzetto di agarosio ha portato a una rapida aggregazione spontanea degli hiPSC per formare un EB in ciascun micropozzetto. La dimensione degli EB è stata controllata con precisione controllando le densità iniziali di semina hiPSC in ciascun micropozzetto.

Gli EB formati possono essere facilmente raccolti manualmente o roboticamente. Variando le dimensioni del pilastro sullo stampo, siamo stati in grado di fabbricare micropozzetti di agarosio fine mediante un semplice stampaggio. Usando la nostra tecnica, siamo stati in grado di produrre un gran numero di EB uniformi e sincronizzati di dimensioni definite.

Gli EB hanno dimostrato strutture ben organizzate con tre strati germinali distinti, un'alta vitalità durante una cultura prolungata e sono in grado di differenziarsi da più linee. Nessuna necrosi core è stata osservata in qualsiasi momento durante la coltura. Per supportare lo sviluppo del nostro sistema basato su micropozzetti come tecnologia di piattaforma per la formazione di hEB da cellule staminali pluripotenti umane dissociate hPSCabbiamo testato fianco a fianco il sistema per la formazione di hEB da altre linee cellulari hPSC come le linee hESC.

Abbiamo testato le condizioni di alimentazione dei fibroblasti embrionali di topo tradizionali MEF e le condizioni prive di alimentatore. Gli EB hESC risultanti erano stabili nei pozzetti e hanno subito crescita e stabilizzazione quando trasferiti in coltura in sospensione.

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È importante iniziare con cellule staminali pluripotenti indifferenziate per garantire che il loro sviluppo in EB sia sincrono e heb sfida di perdita di peso la loro differenziazione a valle verso specifici tipi di cellule.

Come mostrato nella Figura 1, dopo 24 ore gli hiPSC hanno formato spontaneamente dei cluster, che sono stati quindi trasferiti in coltura in sospensione per ulteriore maturazione. Questi cluster avevano apparizioni compatte dopo 24 ore nella coltura in sospensione, suggerendo lo sviluppo di una normale struttura organizzata e complessa di EB. Le distribuzioni delle dimensioni di EB sono state quantificate usando l'analisi di Image-Pro Plus misurando il diametro di ciascun EB e calcolando il volume poiché tutti gli Heb sfida di perdita di peso avevano una forma quasi sferica.

Nei seguenti esperimenti, questa densità di semina delle cellule hiPSC è stata utilizzata per la formazione di EB. Abbiamo anche confrontato il nostro sistema basato su micropozzetti di agarosio con i sistemi esistenti in commercio come le piastre a V e U, e le piastre Aggrewell TM per la formazione di hEB dallo stesso tipo di hiPSC all'interno dello stesso intervallo di heb sfida di perdita di peso delle celle di input nel assenza di centrifugazione e inibitore ROCK.

La formazione di hEB omogenei stabili da hiPSC dissociati non è stata osservata in nessuno dei sistemi disponibili in commercio che sono stati testati. La condensazione della sospensione cellulare era evidente dopo 6 ore di incubazione nei micropozzetti di idrogel e continuava fino all'estrazione di hEB dopo 24 ore di incubazione.

Morfologia grossolana di BEB che sono stati estratti di recente rispetto a 24 ore dopo l'estrazione. Immagine a dimensione intera A1 La probabilità della formazione di EB in funzione della densità delle cellule hiPSC in ingresso per micropozzetto; A2 Morfologia lorda di hEB formati da hiPSC nei pozzetti di idrogel a diversa densità di cellule di input per micropozzetto; B1 La probabilità di formazione di EB in funzione della densità delle cellule hESC di input per micropozzetto; B2 Morfologia lorda di hEB formati da hESC nei pozzetti di idrogel a diversa densità di cellule di input per micropozzetto.

La densità delle celle di input oltre questo intervallo ha provocato la disintegrazione degli aggregati o la mancata aggregazione da parte delle cellule Figura 2B2. Gli hEB presentavano una struttura sferica compatta ben definita con cerchi trasparenti Figura 2B2. Gli hEB formati sono stati quindi trasferiti in coltura in sospensione, dove sono stati sottoposti a crescita e stabilizzazione.

In particolare, l'analisi degli EB di hiPSC in diversi punti temporali al momento dell'estrazione dai pozzetti e dopo 24 ore e 1 settimana in coltura in sospensione ha mostrato un aumento del livello di organizzazione strutturale interna in funzione del tempo Figura 3 A1, A2, A3. I risultati giustificano il nostro sistema basato su micropozzetti di idrogel nel ricapitolare almeno alcuni aspetti dell'embriogenesi precoce e della differenziazione e consentire la generazione non solo di vari tipi di cellule nel differenziare gli EB ma anche nell'ordine a livello dei tessuti simile a quello che si vede durante lo sviluppo embrionale.

Successivamente abbiamo esaminato se il tempo di coltura prolungato consentirebbe la differenziazione a livello di tessuto in tipi di tessuto più specifici. Immagine a dimensione intera La redditività degli hEB in una cultura di sospensione a lungo termine Per dimostrare che gli hEB non erano transitori e sufficientemente longevi da consentire un'ulteriore differenziazione in specifici tipi di cellule, li abbiamo mantenuti in coltura in sospensione per 20 giorni, il periodo richiesto per la formazione di tre strati germinali durante l'embriogenesi.

Per entrambe le condizioni, la densità di semina di hiPSC era di cellule per micropozzetto. Immagine a dimensione intera Verifica della presenza dei tre strati germinali mediante analisi dell'espressione genica e immunofluorescenza Al fine di confermare la pluripotenza degli EB prodotti, perdita di peso con l app verv importante dimostrare che gli EB sono in grado di generare rappresentanti di tutti e tre gli strati germinali dello sviluppo.

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Come saggio preliminare, abbiamo determinato se gli EB esprimessero geni specifici dello strato germinale. Questi dati suggeriscono che la perdita di pluripotenza coincide con la differenziazione verso i lignaggi associati a ciascuno dei tre strati germinali e lo stadio EB rappresenta l'inizio della differenziazione hPSC.

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Questi EB possono essere suscettibili di ulteriori induzioni in specifici tipi di cellule in elevata purezza date adeguate condizioni micro-ambientali. Questi risultati suggeriscono l'applicabilità del nostro approccio alla formazione di hEB basato su micropozzetti a fondo rotondo di agarosio a hPSC dissociati di diverse linee che sono esposti a sistemi o condizioni di terreni di coltura diversi durante il processo di coltura.

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A1, B1 analisi RT-PCR per l'espressione genica gel integrali e macchia sono inclusi nelle informazioni supplementari ; A2, B2 Colorazione a tripla immunofluorescenza che mostra la co-espressione proteica su un singolo cluster EB per ciascuna linea cellulare nella condizione —ROCKi.

Immagine a dimensione intera Gli hEB sono stati indirizzati con successo a differenziarsi in cellule secernenti insulina Per dimostrare che gli hEB formati con il nostro approccio no-ROCK-i e no-centrifugation possono essere ulteriormente indotti a differenziarsi in specifici lignaggi tissutali, abbiamo aggiunto in sequenza un set specifico di fattori solubili, tra cui l'attina A, la nicotinamide e l'EGF alle cellule dopo Formazione di EB per differenziarle in cellule spawn la perdita di peso che producono insulina.

Questi risultati tonico per la perdita di peso della meridiana che heb sfida di perdita di peso a determinate serie di fattori esogeni verso gli hEB formati con il nostro approccio no-Rock-i e no-centrifugazione avrebbe la precedenza sulle traiettorie endogene standard di differenziazione multi-lignaggio con specifiche verso lignaggi più specifici, portando a una produzione efficace di tipi cellulari desiderati di interesse clinico e di ricerca.

La Figura 6A mostra la formazione di cluster uniformi simili a isole dopo 21 giorni di differenziazione.

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Un altro enzima Glucokinase GKche svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo dei carboidrati come sensore di glucosio facilitando la fosforilazione del glucosio in glucosiofosfato, è stato debolmente espresso dalle cellule. Altri geni che sono stati espressi includono, Nkx I nuclei cellulari sono stati colorati in blu con DAPI. La doppia colorazione immunofluorescente dell'insulina e del peptide C ha rivelato la loro co-localizzazione sulle cellule produttrici di insulina Figura 6Econfermando ulteriormente una sintesi de novo dell'insulina che è importante per dimostrare la piena funzionalità delle nostre cellule differenziate.

Il peptide C è un sottoprodotto quando la proinsulina viene trasformata in insulina. Abbiamo anche esaminato l'espressione di due ormoni pancreatici endocrini glucagone e insulina.

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Alla fine della differenziazione pancreatica, l'espressione del glucagone era assente dalle cellule che secernono insulina Figura 6H. Per esplorare ulteriormente le caratteristiche funzionali dei cluster di cellule derivate da hEB dopo la differenziazione pancreatica, la secrezione di insulina è stata misurata dopo la fine del protocollo di differenziazione. Nel gruppo di controllo, non è stata rilevata alcuna secrezione di insulina nei media raccolti dagli hEB indifferenziati con entrambe le concentrazioni di glucosio.

Nel loro insieme, le cellule produttrici di insulina che sono state differenziate dai nostri EB hiPSC hanno mostrato le caratteristiche chiave tipiche delle cellule beta pancreatiche umane mature.

Discussione La differenziazione scalabile controllata e riproducibile delle cellule staminali pluripotenti umane è importante per realizzare il loro pieno potenziale per scopi di ricerca, clinici e industriali, che spesso richiedono una grande quantità di materiali cellulari di lignaggi definiti. Ad oggi, non sono stati sviluppati protocolli adeguati per raggiungere questo obiettivo.

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Tuttavia, EB è associata a una grande variabilità nella differenziazione dovuta all'incapacità di standardizzare la sua produzione. Le cellule staminali pluripotenti umane sembrano essere più delicate e sensibili all'ambiente e, pertanto, richiedono condizioni più rigorose per la loro cultura e differenziazione 33, La nostra ricerca si è concentrata sul superamento delle sfide della cultura e sulla differenziazione diretta delle cellule staminali pluripotenti umane. In particolare, questo studio stabilisce un protocollo di non centrifugazione no-ROCK-i senza xeno-free per la generazione heb sfida di perdita di peso controllata e riproducibile di EB uniformi e sincronizzati da hiPSC.

L'analisi microscopica elettronica ha confermato che questi EB avevano strutture altamente organizzate con una vasta formazione di giunzioni cellula-cellula, tra cui giunzioni strette, giunzioni di aderenza, giunzioni gap e desmosomi, che sono state implicate nella protezione di EBs di origine pluripotente delle cellule staminali dall'apoptosi.

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Gli EB avevano mantenuto un'elevata vitalità durante una cultura prolungata il tempo più lungo che abbiamo testato era di 30 giorni ed erano in grado di differenziare in modo differenziato multi-lignaggio e di differenziare direttamente in specifici lignaggi. Le cellule differenziate esibivano tutte le caratteristiche chiave del lignaggio desiderato e potevano essere potenzialmente utilizzate per applicazioni cliniche e studi biologici. È stato adottato un approccio con micropozzetti non adesivi per una formazione omogenea di EB da hPSC dissociati 38, 39, Gli EB formati usando l'approccio con micropozzetti sono spesso indicati come "spin-EB" poiché la centrifugazione viene solitamente applicata insieme per forzare l'aggregazione all'interno dei micropozzetti.

Nel nostro studio, sono stati creati multiwells a fondo arrotondato non adesivi su idrogel di agarosio e abbiamo dimostrato grande successo nel produrre un gran numero di EB altamente omogenei e sincronizzati da hiPSC dissociati in questi pozzetti con fondo rotondo senza centrifugazione o trattamento ROCK-i.

Dimensioni e forma sono parametri importanti che determinano il successo della formazione di EB da ESC o iPSC e successiva differenziazione 11, 44, Il controllo delle dimensioni dell'EB non è solo importante per mantenere un'alta vitalità degli hiPSC, ma influenza anche il potenziale di proliferazione e differenziazione verso specifici lignaggi cellulari come cardiomiociti 6, 41, cellule endoteliali 46 e tessuti ematopoietici Nel presente studio, gli EB hanno costantemente mostrato morfologia sferica in tutte le condizioni.

La dimensione degli EB, tuttavia, dipendeva dalla densità iniziale di semina delle cellule hiPSC rispetto alla dimensione dei micropozzetti. Abbiamo ipotizzato che esistesse un intervallo di densità delle celle di input per micropozzetti di dimensioni specifiche che promuovevano al meglio la formazione di EB omogenei e sincronizzati. Il nostro esame dell'effetto della densità cellulare hiPSC in ingresso in micropozzetti di agarosio di dimensioni specifiche sulla formazione di EB ha confermato la heb sfida di perdita di peso speculazione.

Precedenti studi avevano suggerito che l'effetto della dimensione dell'EB sulle loro traiettorie di differenziazione era mediato dalle interazioni cellula-cellula 11, 44, 45 e dal controllo all'interno degli EB dei profili di concentrazione dei fattori solubili presenti nel terreno di coltura Gli EB di dimensioni diverse hanno anche variato l'accessibilità dei fattori solubili istruttivi che erano presenti nel mezzo di differenziazione alle cellule in posizioni spaziali diverse all'interno dello stesso EB, quindi alterato la resa in specifiche traiettorie di differenziazione Ottimizzando le densità iniziali di semina in ciascun pozzetto, abbiamo raggiunto un diametro medio di um sugli EB con una distribuzione dimensionale molto stretta.

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L'inibitore ROCK è stato un componente esclusivamente inevitabile in tutti gli studi esistenti sulla formazione di EB da cellule staminali pluripotenti umane dissociate. L'eliminazione di ROCK-i è un vantaggio rivoluzionario di questa nuova tecnica poiché ovvia ai numerosi problemi associati a ROCK-i, che compromettono l'utilità delle cellule differenziate sia in ambito di ricerca che clinico.

Il meccanismo coinvolto nell'eliminazione di ROCK-i dal nostro sistema non è chiaro. I cluster e le giunzioni cellula-cellula in questi cluster hanno dimostrato di essere la chiave per la sopravvivenza delle cellule. Giunzioni aderenti, giunzioni strette, desmosomi e giunzioni vuote sono state segnalate come giunzioni cellula-cellula che aiutano a proteggere le cellule staminali embrionali dall'apoptosi Di particolare importanza sono le giunzioni aderenti formate dalla E-caderina, una proteina chiave che mantiene il contatto cellula-cellula Giunzioni cellula-cellula di vario tipo sono state ampiamente esposte nei nostri EB, indicando che la nostra tecnica ha incoraggiato la formazione di giunzioni cellula-cellula che contribuiscono alla vitalità cellulare e alla formazione di EB.

Esistono diversi protocolli graduali per differenziare gli iPSC o gli hESC in cellule produttrici di insulina in vitro 32, 49, 50, 51, che consistono in due fasi, ovvero derivare progenitori pancreatici positivi PDX-1 dall'endoderma definitivo e differenziazione di PDX-1 cellule positive in cellule produttrici di insulina, tuttavia, le condizioni di coltura e le popolazioni di cellule di input in questi protocolli rimangono da ottimizzare per aumentare l'efficienza di differenziazione.

A partire da EB omogenei e sincronizzati ha permesso una differenziazione graduale che imita il processo di sviluppo del pancreas umano. Sebbene non sia al centro del presente studio, la dissezione del processo di differenziazione ha rivelato l'espressione sequenziale dei geni dello stadio dello sviluppo da parte degli EB con questo protocollo. Inoltre, le cellule differenziate heb sfida di perdita di peso mostrato una forte dipendenza dalla dose di glucosio nella secrezione di insulina in un modo fisiologico che era simile alle cellule beta pancreatiche umane mature.

Questa tecnologia per la formazione di EB è considerevolmente veloce grazie alle interazioni cellula-cellula migliorate all'interno di un intervallo ideale di densità di semina cellulare per un dato volume di micropozzetti, facilitando una rapida aggregazione cellulare.

Una migliore interazione cellula-cellula è fondamentale per formare giunzioni cellulari e attivare meccanismi di segnalazione cellulare che regolano la differenziazione 52, Numerosi studi hanno dimostrato una differenziazione osteogena migliorata in vitro degli ESC di topo a seguito dell'aggregazione cellulare che si verifica negli EB rispetto alle singole cellule dissociate Inoltre, le colture di EB stabilizzate hanno dimostrato una differenziazione osteogenica maggiore rispetto alle colture di EB dissociate